Η εμφάνιση της παραλλαγής στο μήκος του DNA κομμάτια που παράγονται μετά διαχωριστικές με ένα endonuclease τύπου ΙΙ περιορισμό. Οι διαφορές σε μήκη DNA είναι λόγω της παρουσίας ή απουσίας του βιότοπου αναγνώρισης για το συγκεκριμένο ένζυμο περιορισμό. RFLPs αρχικά εντοπίστηκαν με υβριδοποίησης DNA καθετήρες μετά το διαχωρισμό του digested γονιδιωματικής DNA με ηλεκτροφόρηση πηκτής (Νότια ανάλυση). Τώρα αυτοί εντοπίζονται συνήθως με ηλεκτροφόρηση του προϊόντος digested PCR.