Una clase de Endonucleasas que hiende el ADN después de reconocer una secuencia específica, por ejemplo, Bam H1 (5´GGATCC3´), dIII Eco RI (5´GAATTC3´) y Hin (5´AAGCTT3´). Hay tres tipos de enzimas de restricción endonuclease:

tipo I: cortes no específica a una distancia superior a 1000 bp de su secuencia de reconocimiento y contiene las actividades de la restricción y la metilación.

Tipo II: Cortes en o cerca de un cortocircuito y a menudo palindrómico (q.v.), secuencia de reconocimiento. A enzima separada son methylates la misma secuencia de reconocimiento. Pueden hacer que las reducciones en las dos hebras de ADN exactamente uno frente al otro y generar contundentes termina, o pueden hacer cortes escalonados para generar extremos pegajosos. Enzimas de restricción de tipo II son los que comúnmente explotados en tecnología del ADN recombinante.

Tipo III: cortes 24-26 bp aguas abajo de una secuencia de reconocimiento corto, asimétrico. Requiere ATP y contiene las actividades de la restricción y la metilación.