Kelas endonucleases yang bersatu DNA setelah mengenali suatu urutan tertentu, misalnya, Bam H1 (5´GGATCC3´), Eco RI (5´GAATTC3´), dan Hin dIII (5´AAGCTT3´). Ada tiga jenis enzim pembatasan endonuklease:

Type I: memotong bebas-khusus jarak lebih dari 1000 bp dari urutan pengakuan yang dan berisi kegiatan pembatasan dan metilasi.

Tipe II: Luka di atau dekat pendek, dan sering palindromic (q.v), urutan pengakuan. A terpisah enzim methylates pengakuan urutan yang sama. Mereka dapat membuat pemotongan dalam dua untai DNA persis berlawanan satu sama lain dan menghasilkan tumpul berakhir, atau mereka dapat membuat pemotongan terhuyung-huyung untuk menghasilkan lengket berakhir. Tipe II pembatasan enzim yang umumnya dimanfaatkan dalam teknologi DNA rekombinan.

Tipe III: memotong 24-26 bp hilir dari sebuah urutan pendek, asimetris pengakuan. Memerlukan ATP dan berisi pembatasan dan metilasi kegiatan.